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Rac Pulldown Activation Assay Kit

Catalog Number：80501

30 assays

 

產(chǎn)品說明

    

   小 G 蛋白是從屬于細(xì)胞調(diào)節(jié)因子中的一個超家族。Rho 家族是小 G 蛋白中的一個亞家族，它在細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞分裂以及基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮主要作用。而本試劑盒中的 Rac 就屬于Rho 亞家族中的一種， Rac 參與生理活動過程中其分子結(jié)構(gòu)會呈現(xiàn)出 2 種相互轉(zhuǎn)換的形式：與 GTP 結(jié)合的激活狀態(tài)和與 GDP 結(jié)合的非活性狀態(tài)。

   

   目前 Rac蛋白活性的檢測主要是依據(jù)小 GTP 酶 Rac 可以與 p21 活化激酶（PAK）的 p21結(jié)合區(qū)域（PBD）結(jié)合，使 PAK 活化從而發(fā)揮生物學(xué)功能，進(jìn)而間接的進(jìn)行 Rac 活性功能的監(jiān)測。然而此方法在檢測過程中存在著一定的局限性比如 GTP 水解成 GDP 的速度過快以及 Rac-GTP 結(jié)合蛋白與 PBD 結(jié)合區(qū)域之間較低的親和力，導(dǎo)致這種檢測方法的重復(fù)性較差。

    

   而武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司推出的 Rac 活性檢測試劑盒主要是依據(jù)單克隆抗體能夠特異性的識別特殊構(gòu)象的 Rac GTP 結(jié)合蛋白，而不識別 Rac GDP 結(jié)合蛋白，進(jìn)而簡單并且快速的進(jìn)行 Rac 的活性檢測。同時試劑盒中的 Rac GTP 單克隆抗體也可以進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞和組織中 Rac 的活性監(jiān)測。每套試劑盒可以進(jìn)行 30 次檢測。

 

檢測原理

    

   武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的 Rac 活性檢測試劑盒主要是利用識別蛋白特異構(gòu)象的Rac GTP 單克隆抗體特異性的去檢測細(xì)胞提取物或者體外的（樣品需要進(jìn)行 GTPγS 活化處理）活性 Rac GTP 的水平。簡言之，特異性識別 Rac 活化構(gòu)象的鼠單克隆抗體可以特異性結(jié)合細(xì)胞裂解液中的 Rac GTP 活性蛋白，然后利用 Protein A/G 將抗原抗體的結(jié)合物吸附下來，再利用識別 Rac的兔多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡分析進(jìn)行檢測。

 

試劑盒組分及儲存條件

名稱	貨號	規(guī)格	儲存溫度
Anti-active Rac mouse Monoclonal antibody	Cat.#26903	1x35ul	-20℃
Protein A/G Agarose	Cat.#30301	1x600ul	4℃
5xAssay/ lYsis Buffer	Cat.#30303	1x30ml	4℃
Anti-Rac Rabbit polyclonal antiboy	Cat.#21003	1x50ul	-20℃
100xGTP-rS	Cat.#30302	1x50ul	-80℃
100XGDP	Cat.#30304	1x50ul	-80℃
HRP-Goat anti-Rabbit IgG	Cat.#29002	1x50ul	-20℃

注意:使用前應(yīng)將100xGTP-rs和100xGDP 分裝成10管/5ul/每管，并立即放入 -80℃ 凍存，避免反復(fù)凍融。

 

 

 

試劑盒所需自備物品

 

1. 刺激和未刺激的細(xì)胞裂解物；

2. 蛋白酶抑制劑；

3. 4 °C 搖桿或者搖床；

4. 0.5 M EDTA (pH 8.0)；

5. 1 M MgCl2；

6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer；

7. 電泳和免疫印跡相關(guān)試劑；

8. 免疫印跡緩沖液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20)；

9. 免疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA)；

10 ECL 檢測試劑；

 

實(shí)驗(yàn)操作步驟

 

A  試劑制備

1X Assay/Lysis Buffer：實(shí)驗(yàn)前用去離子水將 5X 的 Assay/Lysis 緩沖液稀釋成 1X 的緩沖液，并在使用前加入蛋白酶抑制劑如 1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 µg/mLaprotinin（抑肽酶）。 

 

B  樣品處理

  貼壁細(xì)胞

1. 培養(yǎng)細(xì)胞密度達(dá)到大約 80%-90%之間（直徑 10 cm 培養(yǎng)皿，~107個細(xì)胞），并用活性劑或抑制劑進(jìn)行處理。

2. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

3. 向細(xì)胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。

4. 將培養(yǎng)皿放置于冰上處理 10-20 分鐘。

5. 用細(xì)胞刮棒把細(xì)胞從培養(yǎng)皿下分離下來。

6. 將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

7. 如果核發(fā)生裂解，細(xì)胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時，將細(xì)胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次，以破壞基因    組DNA，從而避免上述情況的出現(xiàn)。

8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

懸浮細(xì)胞

1. 培養(yǎng)細(xì)胞并用活化劑或抑制劑進(jìn)行處理。

2. 計(jì)數(shù)細(xì)胞后離心。

3. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

4. 向細(xì)胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。

5. 反復(fù)吹打細(xì)胞進(jìn)行裂解。

6. 將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

7. 如果核發(fā)生裂解，細(xì)胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時，

  將細(xì)胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次，以破壞基因組DNA,從而避免上述情況的出現(xiàn)。    

8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

 

C.體外用 GTPγS/GDP 處理蛋白以用作陽性和陰性的對照(可選）

 

注意：在細(xì)胞體內(nèi)環(huán)境條件下大約有 10%的 Rac 被激活，而在體外用 GTPγS 處理大約有90%的 Rac 被激活。 

 

1. 準(zhǔn)備兩個離心管，每個管中各加入 0.5 mL 的細(xì)胞提取物（如果是純的 Rac 蛋白則每個管中加入的蛋白量為 1ug）。

2. 每個管中加入 20ul 0.5M EDTA(終濃度即為 20 mM)。

3. 一個管中加入 5ul 的 100X GTPγS（終濃度即為 100 uM）作為陽性對照。另一個管中加入 5ul 的 100X GDP（終濃度即為 1 mM）作為陰性對照。

4. 將離心管置于 30°C 條件下反應(yīng) 30 min 并不斷攪動。

5. 終止反應(yīng)：將管置于冰上并加入 32.5ul 1M MgCl2(終濃度即為 60mM)。 

 

D. 激活Rac的親和沉淀

1. 加入 0.5-1 mL(總蛋白的含量大約為 1mg)的細(xì)胞裂解物至微量離心管中。

2. 用1X Assay/Lysis 緩沖液。把每個樣品的總體積調(diào)整到1ml

3. 向管中加入 1ul 的活性 Rac 單克隆抗體。(Cat.# 26903)

4. 用渦旋振蕩儀將 protein A/G 凝膠柱充分混勻，

5 .然后快速的吸出 20ul 懸浮珠漿液加入離心管中。

6. 將管置于 4°C 條件下孵育1小時，并輕輕的進(jìn)行搖動。

7. 5000g，離心 1 分鐘。

8. 棄上清，這一步要非常小心以避免珠子的損失。

9. 用 0.5 mL 的 1X Assay/Lysis 緩沖液洗滌珠子三次，離心并棄去上清。

10. 最后一次洗滌后，小心的移去所有的上清。

11. 用 20ul 的 2X SDS-PAGE 樣品緩沖液重懸樣品。

12. 樣品煮沸 5min。 

13. 5000g，離心 10s。

 

E. 蛋白印跡實(shí)驗(yàn) 

1. 取 15ul 樣品/孔上樣 17%配體膠。

2. 按照制造商的說明進(jìn)行 SDS-PAGE。

3. 按照制造商的說明將凝膠蛋白轉(zhuǎn)到 PVDF 或硝化纖維素膜。 

4. 將 PVDF 膜浸入 100%甲醇 15s，然后在室溫放置 5 min 晾干。 注意：如果使用的是硝化纖維 素膜，此步省略。 

5. 封閉； 用 TBST 緩沖液配制 5%的脫脂牛奶或者 3%BSA 在室溫下孵育 1小時進(jìn)行封閉，并需要恒定振蕩。 

6 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

7. 孵育一抗：用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 稀釋Anti-Rac pAb(Cat.# 21103),稀釋比例為 1:50-1:1000，主要根據(jù)樣品中含有的 Rac 蛋     白的量）室溫下孵育 1-2 小時，或者 4°C 條件下過夜孵育.

8. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

9. 孵育二抗：（例如羊抗兔 IgG-HRP）用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 按1:1000 稀釋比例稀釋后使用，室溫下孵育 1 小時并恒定振蕩。

10. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

11. 使用實(shí)驗(yàn)者所選擇的檢測方法進(jìn)行顯色如 ECL 顯色法。

 

示例結(jié)果

下圖展示的是武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的 Rac 活性試劑盒的典型結(jié)果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考。

 

 

Rac 活性分析。

 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）用血小板衍生因子（PDGF）處理（Lane 2）和未處理（Lane 1）。細(xì)胞裂解物用特異性識別 Rac 活性構(gòu)象的鼠單克隆抗體(Cat. # 26903)和Protein A/G進(jìn)行孵育，用anti-Rac pAb (Cat # 21003)進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)。(上圖）

 

 底部圖片展示的是細(xì)胞裂解液用anti-Rac pAb (Cat # 21003)進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)（底圖 SDS-PAGE 的上樣量是上圖 SDS-PAGE 上樣量的 5%。）做為參照 

 

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參考文獻(xiàn)

1. PI3K Regulation of RAC1 Is Required for KRAS-Induced Pancreatic Tumorigenesis in Mice

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    種屬：Human

2. Aspect Ratio Determines the Quantity of Mesoporous Silica Nanoparticle Uptake by a Small GTPase-Dependent Macropinocytosis Mechanism

    影響因子：14.588

    應(yīng)用范圍：IP-WB

    種屬：Human

3. Geranylgeranyl pyrophosphate synthase facilitates the organization of cardiomyocytes during mid-gestation through modulating protein geranylgeranylation in mouse heart

    影響因子：10.787

    應(yīng)用范圍：IP-WB

    種屬：mouse

4. Role of Nicotinamide N -Methyltransferase in Dorsal Striatum in Cocaine Place Preference

    影響因子：7.16

    應(yīng)用范圍：IP-WB

    種屬：Human

5. A Stromal Cell-Derived Factor 1α Analogue Improves Endothelial Cell Function in Lipopolysaccharide-Induced Acute Respiratory Distress Syndrome

    影響因子：6.354

    應(yīng)用范圍：IP-WB

    種屬：Human

6. GGPP-Mediated Protein Geranylgeranylation in Oocyte Is Essential for the Establishment of Oocyte-Granulosa Cell Communication and Primary-Secondary Follicle Transition in Mouse Ovary

    影響因子：5.174

    應(yīng)用范圍：IP-WB

    種屬：mouse

7. Scavenger receptor MARCO contributes to macrophage phagocytosis and clearance of tumor cells

    影響因子：3.905

    應(yīng)用范圍：IP-WB

    種屬：mouse

8. Rac1/PAK1 signaling promotes epithelial-mesenchymal transition of podocytes in vitro via triggering β-catenin transcriptional activity under high glucose conditions

    影響因子：3.673

    應(yīng)用范圍：IP-WB

    種屬：mouse

9. Co-Regulation of Transcellular and Paracellular Leak Across Microvascular Endothelium by Dynamin and Rac

    影響因子：3.491

    應(yīng)用范圍：IP-WB

    種屬：mouse

10. Dishevelled-2 regulates cocaine-induced structural plasticity and Rac1 activity in the nucleus accumbens

    影響因子：3.046

    應(yīng)用范圍：IP-WB

    種屬：mous

 

  

示例結(jié)果

下圖展示的是武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的 Rac 活性試劑盒的典型結(jié)果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考。

 

 

Rac 活性分析。

 

  

  鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）用血小板衍生因子（PDGF）處理（Lane 2）和未處理（Lane 1）。細(xì)胞裂解物用特異性識別 Rac 活性構(gòu)象的鼠單克隆抗體(Cat. # 26903)和Protein A/G進(jìn)行孵育，用anti-Rac pAb (Cat # 21003)進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)。(上圖）

  底部圖片展示的是細(xì)胞裂解液用anti-Rac pAb (Cat # 21003)進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)（底圖 SDS-PAGE 的上樣量是上圖 SDS-PAGE 上樣量的 5%。）做為參照