該免疫印跡實驗方法僅供參考，由于每個實驗使用的試劑不同，并且涉及不同的物種，組織類型及實驗應用，實驗人員設計應根據具體情況設計實驗步驟和改良。

阻斷

1. 使用 5% 脫脂奶粉溶于 1X TBST 作為阻斷緩沖液.

2. 使用足夠多的阻斷緩沖液確保凝膠被完全覆蓋.

3. 室溫下阻斷并震蕩1小時.

沖洗

1. 1X TBST 中沖洗3次，每次4分鐘，然后1X TBS中沖洗 3次，每次4分鐘.

2. 確保在盒子里一直都有足夠的沖洗緩沖液.

一抗孵育

1. 將一抗在 TBST中稀釋.

2. 室溫下震蕩孵育 2 小時.

3. 時而檢查凝膠確認其完全被抗體溶液覆蓋.

沖洗

1. 1X TBST 中沖洗3次，每次4分鐘，然后1X TBS中沖洗 3次，每次4分鐘.

2. 確保在盒子里一直都有足夠的沖洗緩沖液.

二抗孵育

1. 在1X TBST (濃度根據使用的抗體而定) 中制備二抗.

2. 室溫下震蕩孵育 1 小時.

3. 時而檢查凝膠確認其完全被抗體溶液覆蓋.

沖洗

1. 1X TBST 中沖洗3次，每次4分鐘，然后1X TBS中沖洗 3次，每次4分鐘.

2. 確保在盒子里一直都有足夠的沖洗緩沖液.

檢測

ECL檢測試劑的用量取決于凝膠的大小. 通常來說, 用量需要足夠完全覆蓋凝膠.

1. 1:1 混合溶液 A 和溶液 B.

2. 用鑷子夾起凝膠，輕輕拍在無塵擦紙上，去除凝膠上多余的 Tris.

3. 把凝膠放在新的干凈的盒子里，加入檢測試劑，確保凝膠均勻的被覆蓋.

4. 在黑暗中孵育凝膠 5 分鐘.

5. 用鑷子夾起凝膠，用無塵擦紙洗掉多余的試劑.

6. 凝膠成像.