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產品說明

 

     小 G 蛋白是從屬于細胞調節因子中的一個超家族。Rho 家族是小 G 蛋白中的一個亞家族，它在細胞運動、細胞分裂以及基因轉錄中發揮主要作用。而本試劑盒中的 RhoA 就屬于Rho 亞家族中的一種， RhoA 參與生理活動過程中其分子結構會呈現出 2 種相互轉換的形式：與 GTP 結合的激活狀態和與 GDP 結合的非活性狀態。 

目前RhoA蛋白活性的檢測主要是依據小GTP酶RhoA可以與RhoA效應蛋白(Rhotekin)的 RBD 區域結合，使 RhoA 效應蛋白活化從而發揮生物學功能，進而間接的進行 RhoA 活性功能的監測。然而此方法在檢測過程中存在著一定的局限性比如 GTP 水解成 GDP 的速度過快以及 RhoA-GTP 結合蛋白與 RBD 結合區域之間較低的親和力，導致這種檢測方法的重復性較差。

         而武漢紐斯特生物技術有限公司推出的 RhoA 活性檢測試劑盒主要是依據單克隆抗體能夠特異性的識別特殊構象的 RhoA-GTP 結合蛋白，而不識別 RhoA-GDP 結合蛋白，進而簡單并且快速的進行 RhoA 的活性檢測。同時試劑盒中的 RhoA-GTP 單克隆抗體也可以進行免疫組化實驗中細胞和組織中 RhoA 的活性監測。每套試劑盒可以進行 30 次檢測.

 

檢測原理

 

    武漢紐斯特生物技術有限公司的 RhoA 活性檢測試劑盒主要是利用識別蛋白特異構象的 RhoA-GTP 單克隆抗體特異性的去檢測細胞提取物或者體外的（樣品需要進行 GTPγS 活化處理）活性 RhoA-GTP 的水平。簡言之，特異性識別 RhoA 活化構象的鼠單克隆抗體可以特異性結合細胞裂解液中的 RhoA-GTP 活性蛋白，然后利用Protein A/G 將抗原抗體的結合物吸附下來，再利用特異性識別 RhoA 的兔多克隆抗體進行免疫印跡分析進行檢測。

 

試劑盒組份及儲存

名稱	貨號	規格	儲存溫度
Anti-active Rhoa mouse Monoclonal antibody	Cat.#26904	1x35ul	-20℃
Protein A/G Agarose	Cat.#30301	1x600ul	4℃
5xAssay/ lYsis Buffer	Cat.#30303	1x30ml	4℃
Anti-Rhoa Rabbit polyclonal antiboy	Cat.#21017	1x50ul	-20℃
100xGTP-rS	Cat.#30302	1x50ul	-80℃
100XGDP	Cat.#30304	1x50ul	-80℃
HRP-Goat anti-Rabbit IgG	Cat.#29002	1x50ul	-20℃

 

注意:使用前應將100xGTP-rs和100xGDP 分裝成10管/5ul/每管，并立即放入 -80℃ 凍存，避免反復凍融。

 

試劑盒所需自備物品。

 

1.刺激和未刺激的細胞裂解物；

2. 蛋白酶抑制劑；

3. 4 °C 搖桿或者搖床；

4. 0.5 M EDTA (pH 8.0)；

5. 1 M MgCl2；

6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer；

7. 電泳和免疫印跡相關試劑；

8. 免疫印跡緩沖液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20)；

9. 免疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA)；

10 ECL 檢測試劑；

 

試劑盒注意事項

 

1.收到試劑盒后如不立即使用，請將試劑盒組分按照標簽說明存儲在相應的溫度，100xGTP-rs和100xGDP 分裝成10管/5ul/每管，并立即放入 -80℃ 凍存，避免反復凍融。 

2.Protein A/G Agarose使用前請稍微離心甩一下，因管壁上可能殘留，而且是用20%乙醇保存的，如果乙醇揮發，體積較少時很難將Agarose吹散，所以請補充20%乙醇等于Agarose的體積。

3.. 使用50% 的Protein A/G Agarose前先用槍將其吹勻，一個反應管使用20 ul的50% 的Protein A/G Agarose足夠。

4. 將50% 的Protein A/G Agarose加入反應管前先用1×Assay/Lysis Buffer洗滌3遍，以去除其中的乙醇，最后一遍用合適體積的1×Assay/Lysis Buffer懸浮Agarose，再分裝于 反應管，保證每管參與反應的50% 的Protein A/G Agarose有20 ul。

5. 為了減少50% 的Protein A/G Agarose的損失，可以先在反應管中加入適當體積的1×Assay/Lysis Buffer。

6. 反應管中試劑加入順序建議，先1×Assay/Lysis Buffer，然后是用Buffer稀釋的Protein A/G Agarose，細胞裂解液和活性抗體，總體積建議0.5ml-1ml

7. 活性抗體的加入量請適當做調整，如可以加入0.5ug、1ug或者2ug。

8. 孵育反應在4℃ 360度搖床進行。

9. 反應完畢，洗滌Agarose時候，盡量避免吸走Agarose。

 

 實驗操作步驟

 

A  試劑制備

1X Assay/Lysis Buffer：實驗前用去離子水將 5X 的 Assay/Lysis 緩沖液稀釋成 1X 的緩沖液，并在使用前加入蛋白酶抑制劑如 1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 µg/mLaprotinin（抑肽酶）。 

 B  樣品處理

 貼壁細胞

1.培養細胞密度達到大約 80%-90%之間（直徑 10 cm 培養皿，~107個細胞），并用活性劑或抑制劑進行處理.

2.吸去培養基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

3.  向細胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個直徑 10cm 的組織培養皿中加入 0.5-1mL）。

4.  將培養皿放置于冰上處理 10-20 分鐘。

5.  用細胞刮棒把細胞從培養皿下分離下來。

6.  將細胞裂解物轉入合適的管中并放置于冰上。

7.  如果核發生裂解,細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現時,將細胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取3-4次，以破壞基 因組DNA,從而避免上述情況的出現。

8.  4度12000g, 離心 10 min。

9.  收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

 

懸浮細胞

1.培養細胞并用活化劑或抑制劑進行處理。

2. 計數細胞后離心。

3.吸去培養基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

4. 向細胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個直徑 10cm 的組織培養皿中加入 0.5-1mL）。

5.反復吹打細胞進行裂解。

6.將細胞裂解物轉入合適的管中并放置于冰上。

7.如果核發生裂解，細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現時，將細胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次，以破壞基因組DNA,從而避免上述情況的出現。    

8.4°C 12000 g, 離心10min。

9. 收集上清（~1-2 mg總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

 

C.體外用 GTPγS/GDP 處理蛋白以用作陽性和陰性的對照(可選）

 

注意：在細胞體內環境條件下大約有 10%的 RhoA 被激活，而在體外用 GTPγS 處理大約有90%的 RhoA 被激活。 

1. 準備兩個離心管，每個管中各加入 0.5 mL 的細胞提取物（如果是純的RhoA蛋白則每個管中加入的蛋白量為1ug）。

2. 每個管中加入 20ul 0.5M EDTA(終濃度即為 20 mM)。

3. 一個管中加入 5ul 的 100X GTPγS（終濃度即為 100 uM）作為陽性對照。另一個管中加入5ul 的 100X GDP（終濃度即為 1 mM）作為陰性對照。

4. 將離心管置于 30°C 條件下反應 30 min 并不斷攪動。

5. 終止反應：將管置于冰上并加入 32.5ul 1M MgCl2(終濃度即為 60mM)。 

 

D. 激活 RhoA 的親和沉淀

 

1. 加入 0.5-1 mL(總蛋白的含量大約為 1mg)的細胞裂解物至微量離心管中。

2. 用1X Assay/Lysis 緩沖液。把每個樣品的總體積調整到1ml 

3. 向管中加入 1ul 的活性 RhoA 單克隆抗體。(Cat.# 26904)

4. 用渦旋振蕩儀將 protein A/G 凝膠柱充分混勻，

5 .然后快速的吸出 20ul 懸浮珠漿液加入離心管中。

6. 將管置于 4°C 條件下孵育1小時，并輕輕的進行搖動。

7. 5000g，離心 1 分鐘。

8. 棄上清，這一步要非常小心以避免珠子的損失。

9. 用 0.5 mL 的 1X Assay/Lysis 緩沖液洗滌珠子三次，離心并棄去上清。

10. 最后一次洗滌后，小心的移去所有的上清。

11. 用 20ul 的 2X SDS-PAGE 樣品緩沖液重懸樣品。

12. 樣品煮沸 5min。 

13. 5000g，離心 10s。

 

E. 蛋白印跡實驗 

1. 取 15ul 樣品/孔上樣 17%配體膠。

2. 按照制造商的說明進行 SDS-PAGE。

3. 按照制造商的說明將凝膠蛋白轉到 PVDF 或硝化纖維素膜。 

4. 將 PVDF 膜浸入 100%甲醇 15s，然后在室溫放置 5 min 晾干。 注意：如果使用的是硝化纖維 素膜，此步省略。 

5. 封閉； 用 TBST 緩沖液配制 5%的脫脂牛奶或者 3%BSA 在室溫下孵育 1小時進行封閉，并需要恒定振蕩。 

6 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

7. 孵育一抗：用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA Anti-RhoApAb(Cat.#21009),稀釋比例為 1:50-1:1000，主要根據樣品中含有的 RhoA 蛋 的量）室溫下孵育 1-2 小時，或者 4°C 條件下過夜孵育.

8. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

9. 孵育二抗：（例如羊抗兔 IgG-HRP）用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 按1:1000 稀釋比例稀釋后使用，室溫下孵育 1 小時并恒定振蕩。

10. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

11. 使用實驗者所選擇的檢測方法進行顯色如 ECL 顯色法。

 

 示例結果

 

下圖展示的是武漢紐斯特生物技術有限公司的 RhoA 活性試劑盒的典型結果。下面的數據僅供參考。 

 

Rho 活性分析。小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）用血小板衍生因子（PDGF）處理（Lane 2）和未處理（Lane 1）。細胞裂解物用特異性識別 RhoA 活性構象的鼠單克隆抗體(Cat#26904)孵育(上圖)。親和沉淀物用anti-RhoA pAb(Cat#21009)進行免疫印跡實驗。底部的圖展示的是細胞裂解液的活性RhoA 的 Western blot 實驗結果

 

         

        與傳統的 GST- pull down 方法相比，該試劑盒具有以下明顯優勢

 

1.    靈敏度高；誘導蛋白與目標蛋白中的結合對蛋白量的要求比較高。而抗體與蛋白的結合對樣本中蛋白的要求比較少。

2. 特異性強；因為誘餌蛋白是需要加上GST標簽的重組蛋白，所以是非生理狀態下的驗證，蛋白質的結構和形式可能與天然狀態下存在一定差異，而抗體與目標蛋白的結合 ，活細胞狀態下蛋白質之間的相互作用被保持，所以其反映的是細胞中真實的蛋白情況.

3. 應用更為廣泛；試劑盒中能夠特異性識別GTP結合狀態的三聚體G蛋白或者小G蛋白的單克隆抗體，適應各種種屬（Human，Mouse，Rat，Rice plants，Pig Cotton，bacteria，Escherichia coli等）應用范圍非常廣泛（ IP ,WB ,IHC IF ICF,ICC,IHF.FC,Elisa 等）隨著這些應用的普及，G 蛋白信號轉導的研究進展，必將進一步加快。

 

 

 

 

 

 

 

示例結果

 

下圖展示的是武漢紐斯特生物技術有限公司的 RhoA 活性試劑盒的典型結果。下面的數據僅供參考。 

 

 

 

 

Rho 活性分析。小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）用血小板衍生因子（PDGF）處理（Lane 2）和未處理（Lane 1）。細胞裂解物用特異性識別 RhoA 活性構象的鼠單克隆抗體(Cat. # 26904)孵育(上圖)。親和沉淀物用anti-RhoA pAb(Cat # 21009)進行免疫印跡實驗。底部的圖展示的是細胞裂解液的活性 RhoA 的 Western blot 實驗結果。