2019精品手机国产品在线,国产肥熟女大屁股视频,无码人妻一区二区三区 AV,韩国和日本免费不卡在线V

英文名稱 ：cAMP(Cyclic adenosine monophosphate) ELISA KIT

規   格：96T

貨   號：80203

 

靈敏度：22.9fmol/ml   檢測范圍：0.08pmol/ml-250pmol/ml

 

產品說明

環磷腺苷酸(cAMP)和環磷鳥苷酸(cGMP)是在通過對特定蛋白激酶作用來調節細胞內能量代謝的過程中非常重要的第二信使分子。兩者都富含于中樞神經系統當中,AMP參與較高的皮質功能,而cGMP參與光轉導。cAMP是三磷酸腺苷(ATP)的衍生物 ，在多種不同生物體的細胞內介導cAMP依賴的信號轉導通路。cAMP參與細胞代謝、分化、增殖的跨 膜調控機制在惡性生長中具有良好的 細胞抑制和調節體內平衡的作用。

目前商業化提供的一些cAMP檢測試劑盒主要應用ELISA的方案 ，使用的是非親和純化的cAMP多克隆抗體.盡管具有靈敏性,這些多克隆抗體與ATP存在一定程度的交叉反應。基于ATP是cAMP生產的底物 很有必要找到一種能高特異性識別cAMP的抗體。

紐斯特生物開發出了唯一的鼠單克隆抗體的cAMP ELISA 檢測試劑盒。該單克隆抗體對cAMP的特異性比cAMP、ATP等類似的小分子高出108 倍以上。相較于其他的多克隆抗體cAMP試劑盒,紐斯特生物cAMP ELISA試劑盒能顯著的提高其靈敏性和特異性 ，且能有效避免來自動物多克隆抗體的批次間差異 ，因此可以提供長久有效地可重復性定量檢測。

紐斯特生物cAMP ELISA試劑盒能顯著的提高其靈敏性和特異性,且能有效避免來自動物多克隆抗體的批次間差異 ，因此可以提供長久有效地可重復性定量檢測。此外 ，其他ELISA試劑盒的多克 隆抗cAMP抗體與乙酰化cAMP的親和力明顯高于非乙酰化cAMP.本試劑盒的單克隆cAMP抗體與乙酰化或非乙酰化cAMP具有同樣的親和力。因此.紐斯特生物cAMP ELISA試劑盒中的樣品和標準品不需要乙酰化處理 ，從而明顯縮短了分析時間 ，有效避免了乙酰化過程中的有機試劑的使用 ，為大家提供了一個更安全.更健康的工作環境。

 

實驗原理

本試劑盒利用競爭酶聯免疫分析方法來測定細胞提取物或體外腺苷酸環化酶實驗中的cAMP的水平。簡而言之，將羊抗鼠多克隆抗體包被在酶標板上,細胞提取物或體外腺苷酸環化酶實驗中的cAMP與固定數量的偶聯辣根過氧化物酶的cAMP或堿性磷酸酶競爭性的結合抗cAMP單克隆抗體,已知的cAMP作為標準品來做標準曲線。經過一段時間孵育 ，洗掉所有試劑 ，加入底物進行顯色。將 多孔板置于酶標儀上 于450nm或405nm波長下 ，進行讀數。黃色的光強度與樣品中cAMP的濃度 呈反比關系。基于cAMP標準品所得曲線 ，通過測得的光密度可以計算出樣品中cAMP的濃度。

研究背景:cAMP作為獨特的第二信使 ，可調節細胞對各種外源和內源信號分子的反應。它主要通過激活蛋 白激酶、控制特定的離子通道、磷酸二酯酶調節細胞環核苷酸濃度以及激Epac(通過cAMP直接激活蛋白交換)(3-6)來調節生理過程。通過腺苷酸環化酶可以實現ATP轉化為cAMP。哺乳動物體內的主 要腺苷酸環化酶家族均是橫跨膜的 ，具有9個亞型 ，且可通過G蛋白Gs或鈣離子/鈣調素(1)激活。另外,還有一種可溶性的腺苷酸環化酶.可以通過碳酸鹽或Ca2 +調節(7)。

 

試劑盒組分及保存

  

組份	貨號	儲存溫度
1.Goat anti-Mouse IgG Coated plate of 96 wells 12x8 well strips in a bag with desiccant	30101	2-8℃
2. cAMP-HRP 1000x stock of HRP conjugated with cAMP, 1x6ul	30202	-80°C
3. cAMP Antibody Anti-cAMP monoclonal antibody (1000X stock), 1x6ul	26002-2	-80°C
4. Neutralizing Reagent tris buffered saline with preservative, 1x6mL	30103	2-8℃
5.10x Assay Buffer phosphate buffer with preservative, 1x15mL	30106	2-8℃
6. cAMP Standard 5000 pmol/mL cAMP, 1x0.1mL	30203	-80°C
7.Substrate A 12ml	30107	2-8℃
8.Substrate B 12ml	30108	2-8℃
9.Sample Diluent                                                                   0.1M HCl, only required for extraction of samples and diluting standard, 1x15mL	30109	2-8℃
10. Stop Solution 2M sulphuric acid, 1x6mL	30110	2-8℃

注：收到試劑盒后 ，若不立即使用 ，請按照標簽說明存儲在相應的溫度。

 

試劑盒所需自備物品

1.去離子水或蒸餾水。

2.濃鹽酸。

3.量程在5μ L至1000μ L之間的精密移液管。

4.量程為50μ L和200μ L的中繼移液器。

5.用于稀釋儲液的一次性燒杯。

6.刻度量筒。

7.微孔板振蕩器。

8.吸水紙。

9.酶標儀 ，可讀波長450nm ，在570nm至590nm之間應有修正。

 

樣品處理：

 

紐斯特生物的ELISA試劑盒適用于檢測經過鹽酸處理而終止內源性磷酸二酯酶活性的cAMP樣品。這種樣品可直接應用于檢測,而不需要蒸發 和進一步的處理。

組織樣本：需預先冰凍于液氮中。在不銹鋼研缽中用液氮將組子樣本研磨成精細粉末。待液氮揮 發完后 ，稱量冰凍組織樣本并加入10倍體積的0.1M HCl混勻。室溫以大于600g離心力離心 ，取上層清夜用0.1M HCl稀釋至適當濃度。

細胞樣本：首先移除培養基,然后加入0.1MHCl處理細胞。孵育10分鐘,并觀察細胞是否被裂解；如果裂解充分,接著孵育10分鐘并觀察。  以大于600g離心力于室溫離心,收集上清直接用于實驗。臨用前在0.1M HCl中加入0.1%至1%濃度的Triton-x 100可增強細胞和組織裂解。

尿液，血漿和培養液：每ml樣品中加入10µL濃鹽酸（12M）混勻后，室溫離心5min（600 g）留上清，用于本試劑盒檢測。血漿、血清、全血和組織勻漿通常含有磷酸二酯酶（phosphodiesterases）和大量免疫球蛋白（Ig），它們會干擾實驗。用0.1 M HCl處理樣品，可以滅活磷酸二酯酶和降低免疫球蛋白的濃度，使之可以用于本試劑盒。

 

試劑盒注意事項:

 

 1.收到試劑盒后若不立即使用,請將試劑按照標簽說明存儲在相應的溫度,-80℃低溫保存的抗體和酶儲液為避免反復凍融請按每次需要量進行分裝凍 存,若立即使用，請將整個試劑盒置于4℃保存。

2.使用前請將試劑盒各個試劑平衡到室溫(至少30min)  。

3.用試劑預先潤洗槍頭在使用；取各種樣品、標準品和試劑必需更換槍頭。

4.移取標準品和樣品到微孔底部。

5.從微孔的邊緣加入試劑,以避免污染。

6.本試劑盒使用可拆分的微孔酶標條,使用者可根據樣品量多少進行拆分。未使用的酶標條保持干燥,密封于試劑盒提供的鋁封袋中,于4℃保存。微孔酶標條需安裝在相應的框架上使用。

7.在加入顯色底物前 ，確保微孔內沒有殘留的洗滌液。微量殘留的洗滌液可能導致分析結果的變化。

 

試劑制備

 

1.非乙酰化cAMP標準品溶液

 

  將5000 pmol/mL cAMP標準品溶液平衡至室溫。從#1至#6標記六只潔凈試管。移取475μL 0.1M HCl到#1號試管,400μL到#2至#6號試管。加入25μL 5000 pmol/mL cAMP標準品到#1管中,劇烈渦旋震蕩。從#1管中取出100μL溶液至#2管中,渦旋震蕩。以此類推，重復上步操作.梯度稀釋至#6管。經以上操作，#1至#6管中cAMP標準品濃度分別為250, 50，10, 2, 0.4 和0.08 pmol/mL (詳見cAMP實驗稀釋操作流程圖).稀釋過的標準品需在30分鐘內使用。標記一只試管作為無標準品空白對照(NSB)。移取600μL 0.1M HCl到NSB管中。

 

 2.洗滌液

 

  將15mL 10×洗滌液儲液加到135 mL去離子水中，稀釋成工作液。稀釋液可在室溫保存至試劑盒有效期限,或者3個月。

 

3. cAMP-HRP Conjugate工作液

 

  實驗前計算當次實驗所需用量(以50ul/孔計算)，實際配置時應多配置100-200ul.使用前15分鐘，用配好的1xAssay Buffer,將cAMP-HRP Conjugate (1000X),稀釋成1x工作濃度。當日使用。

 

4.Anti-cAMP McAb工作液

 

 實驗前計算當次實驗所需用量(以50ul/孔計算)，實際配置時應多配置100-200ul.使用前15分鐘 ，用配好的1xAssay Buffer,將cAMP-HRP Conjugate (1000×) 稀釋成1x工作濃度。當日使用。

 

5.操作步驟

使用前將各種試劑取出放置30分鐘,平衡至室溫。所有標準品和樣品必需設置平行對照實驗。快速加入試劑至樣品中,立即漩渦震蕩2秒混勻。

1.依據實驗鍵盤紙決定酶標條的使用量,將剩余的酶標條連同干燥劑一起放回密封塑料袋，密封，4℃保存。

2.移取50μL中和液至各個微孔中 除了TA(Total Activity)孔和Blank(空白)孔。

3.移取100μL 0.1M HCl至NSB (Non-Specific Binding)孔和B0孔(0pmol/mL cAMP標準品)。

4. 移取100μL cAMP標準品至相應的孔。

5. 移取100μL樣品至相應的孔。

6. 移取50μ L 0.1M HCl至NSB  ( Non-Specific Binding)  孔。

7.移取50μ L 偶聯酶至各孔中 ，除了TA  (Total Activity)  孔和Blank(空白)孔。

8. 移取50μ L 抗體工作液至各孔中 ，除了TA  (Total Activity)  孔Blank(空白)孔和NSB  ( Non-Spe cific Binding)  孔。

9. 將酶標孔置于孔板振動器上 ，250~500rpm ，室溫孵育2時。           

10. 在吸水紙上拍干微孔內溶液 ，加洗滌液300μ L每孔洗三次 ，每次需拍干。

11. 最后一次洗滌 ，清空各微孔 ，在干凈的無塵吸水紙上輕巧酶標板數次 ，以確保沒有洗滌液殘留。

12. 加5μ L 偶聯酶至TA  (Total Activity)  孔。

13.每孔200μ L顯色底物溶液 ，于室溫靜置5~30分鐘。    (顯色底物A和B需在臨用前15分鐘內等體積 混合 ，并避光放置。  )

14. 每孔加入50μ L終止液。終止后立即讀數。

15.清除酶標儀Blank(空白)孔值 ，讀取450nm處的光密度值 ，在570nm至590nm之間最好有修正。 如果酶標儀不能自動清除Blank(空白)孔值 ，那么手動扣除每個讀數的Blank(空白)孔光密度值。

 

結果判斷

1 樣品和標準品的凈光密度(OD)平均值的計算：凈OD平均值 = OD平均值－NSB孔OD平均值
2 計算不同梯度濃度標準品的結合率占最大結合率(B0孔)的百分比 ，計算公式 如下： 百分比值 = (凈OD平均值/ B0孔OD平均值)×100
3 以標準品濃度為橫坐標，凈OD值為縱坐標，通過四參數 Logistic 曲線擬合繪制出標準曲線，通過樣品中的插值，即可得到樣品中cAMP的濃度

 

標準曲線

下面的曲線不能用于計算cAMP濃度。每次實驗需新做一條標準曲線。

 

   

 

靈敏度

通過比較10個B0孔平均光密度值(OD)和10個5號管標準品的平均光密度值 ，計算出靈敏度。cAMP 濃度的檢測極限通過標準曲線上0位置的兩個標準偏差來測定。

OD(B0平均數) =0.685± 0.003

OD  ( 5號 標準品平均數)  =0.604± 0.010

光密度偏差(0-0.4 pmol/mL) =0.081

2 SD's of the Zero Standard =0.006

靈敏度 =081.0006.0/0.8 ×0.4 pmol/mL =29.6 fmol/mL

 

 

線性關系

 

cAMP濃度為16.0pmol/mL的樣品，用0.1M HCl進行連續七次1:2梯度稀釋。將實際的cAMP濃度和測定的cAMP濃度繪制圖表。該直線的斜率為1.000 ，相關系數為0.999。

  交叉反應部分相關化合物的交叉反應由競爭ELISA測定。將可能的交叉反應物溶解到試劑盒分析緩沖液中 ，濃度從500pmol/mL- 500,000pmol/mL。這些樣品通過乙酰化在cAMP競爭分析中被測定 ，通過比  較樣品中交叉試劑的實際濃度 ，可以計算出交叉反應 ，并用百分比(%)表示。