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Pan-Ras Activation Assay Kit

Catalog Number：81101

30 assays

 

產品說明

    

       小GTPases是細胞信號調節因子的一個超級家族。Ras屬于GTPases的Ras亞家族，調控細胞生長、細胞運動和基因轉錄。GTP結合增加了Ras的活性，而GTP水 解為GDP則使其失活。目前，Ras蛋白的激活是通過將GTP結合的Ras結合到Raf蛋白激酶的Ras結合域(RBD)來檢測的。這種方法是基于觀察到活性的，與GTP結合的 Ras可以與Raf的RBD結合。但該方法的重現性較差。這部分是由于在檢測過程中GTP相對快速地水解到GDP，并且RBD與Ras-GTP的結合親和力較低。

   

   而武漢紐斯特生物技術有限公司推出的 Ras 活性檢測試劑盒主要是依據單克隆抗體能夠特異性的識別特殊構象的 Ras GTP 結合蛋白而不識Ras GDP 結合蛋白(H-Ras,K-Ras和N-Ras)進而簡單并且快速的進行 Ras 的活性檢測。同時試劑盒中的 Ras GTP 單克隆抗體也可以進行免疫組化實驗中細胞和組織中 Ras的活性監測。每套試劑盒可以進行 30 次檢測

 

 

檢測原理

 

 武漢紐斯特生物技術有限公司的Ras活性檢測試劑盒主要是利用識別蛋白特異構象的Ras-GTP單克隆抗體特異性的去檢測細胞提取物或者體外的（樣品需要進行GTPγS活化處理）活性Ras-GTP的水平。簡言之，特異性識別Ras活化構象的鼠單克隆抗體可以特異性結合細胞裂解液中的Ras-GTP活性蛋白(H-Ras,K-Ras和N-Ras)，然后利用 Protein A/G將抗原抗體的結合物吸附下來，再利用Anti-Pan Ras PAb進行免疫印跡分析進行檢測。

 

 試劑盒組份及保存

 

 

 

 試劑盒所需自備物品

 

1. 刺激和未刺激的細胞裂解物；

2. 蛋白酶抑制劑；

3. 4 °C 搖桿或者搖床；

4. 0.5 M EDTA (pH 8.0)；

5. 1 M MgCl2；

6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer；

7. 電泳和免疫印跡相關試劑；

8. 免疫印跡緩沖液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20)；

9. 免疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA)；

10 ECL 檢測試劑；

 

 實驗操作步驟

 

A  試劑制備

1X Assay/Lysis Buffer：實驗前用去離子水將 5X 的 Assay/Lysis 緩沖液稀釋成 1X 的緩沖液，并在使用前加入蛋白酶抑制劑如 1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 µg/mLaprotinin（抑肽酶）。 

 

B  樣品處理

  貼壁細胞

1. 培養細胞密度達到大約 80%-90%之間（直徑 10 cm 培養皿，~107個細胞），并用活性劑或抑制劑進行處理。

2. 吸去培養基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

3. 向細胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個直徑 10cm 的組織培養皿中加入 0.5-1mL）。

4. 將培養皿放置于冰上處理 10-20 分鐘。

5. 用細胞刮棒把細胞從培養皿下分離下來。

6. 將細胞裂解物轉入合適的管中并放置于冰上。

7. 如果核發生裂解，細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現時，將細胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次，以破壞基因    組DNA，從而避免上述情況的出現。

8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

懸浮細胞

1. 培養細胞并用活化劑或抑制劑進行處理。

2. 計數細胞后離心。

3. 吸去培養基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

4. 向細胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個直徑 10cm 的組織培養皿中加入 0.5-1mL）。

5. 反復吹打細胞進行裂解。

6. 將細胞裂解物轉入合適的管中并放置于冰上。

7. 如果核發生裂解，細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現時，

  將細胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次，以破壞基因組DNA,從而避免上述情況的出現。    

8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

 

C.體外用 GTPγS/GDP 處理蛋白以用作陽性和陰性的對照(可選）

 

注意：在細胞體內環境條件下大約有 10% 的 Ras 被激活，而在體外用 GTPγS 處理大約有90%的 Ras 被激活。 

 

1. 準備兩個離心管，每個管中各加入 0.5 mL 的細胞提取物（如果是純的 Ras 蛋白則每個管中加入的蛋白量為 1ug）。

2. 每個管中加入 20ul 0.5M EDTA(終濃度即為 20 mM)。

3. 一個管中加入 5ul 的 100X GTPγS（終濃度即為 100 uM）作為陽性對照。另一個管中加入 5ul 的 100X GDP（終濃度即為 1 mM）作為陰性對照。

4. 將離心管置于 30°C 條件下反應 30 min 并不斷攪動。

5. 終止反應：將管置于冰上并加入 32.5ul 1M MgCl2(終濃度即為 60mM)。 

 

D. 激活 Ras 的親和沉淀

1. 加入 0.5-1 mL(總蛋白的含量大約為 1mg)的細胞裂解物至微量離心管中。

2. 用 1X Assay/Lysis 緩沖液。把每個樣品的總體積調整到1ml

3. 向管中加入 1ul 的活性 Ras 單克隆抗體。(Cat.# 26909)

4. 用渦旋振蕩儀將 protein A/G 凝膠柱充分混勻，

5 .然后快速的吸出 20ul 懸浮珠漿液加入離心管中。

6. 將管置于 4°C 條件下孵育1小時，并輕輕的進行搖動。

7. 5000g，離心 1 分鐘。

8. 棄上清，這一步要非常小心以避免珠子的損失。

9. 用 0.5 mL 的 1X Assay/Lysis 緩沖液洗滌珠子三次，離心并棄去上清。

10. 最后一次洗滌后，小心的移去所有的上清。

11. 用 20ul 的 2X SDS-PAGE 樣品緩沖液重懸樣品。

12. 樣品煮沸 5min。 

13. 5000g，離心 10s。

 

E. 蛋白印跡實驗 

 

1.取 15ul 樣品/孔上樣 17%配體膠。

 

2. 按照制造商的說明進行 SDS-PAGE。

3. 按照制造商的說明將凝膠蛋白轉到 PVDF 或硝化纖維素膜。 

4. 將 PVDF 膜浸入 100%甲醇 15s，然后在室溫放置 5 min 晾干。 注意：如果使用的是硝化纖維 素膜，此步省略。 

5. 封閉； 用 TBST 緩沖液配制 5%的脫脂牛奶或者 3%BSA 在室溫下孵育 1小時進行封閉，并需要恒定振蕩。 

6 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

7. 孵育一抗：用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 稀釋Anti-Ras PAb(Cat.# 21021),稀釋比例為 1:50-1:1000，主要根據樣品中含有的 Ras 蛋 白的量）室溫下孵育 1-2 小時，或者 4°C 條件下過夜孵育.

8. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

9. 孵育二抗：（例如羊抗兔 IgG-HRP）用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 按1:1000 稀釋比例稀釋后使用，室溫下孵育 1 小時并恒定振蕩。

10. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

11. 使用實驗者所選擇的檢測方法進行顯色如 ECL 顯色法。

 

 

 示例結果

 

下圖展示的是武漢紐斯特生物技術有限公司的 Ras 活性試劑盒的典型結果。下面的數據僅供參考

 

 Ras 活性分析

 Ras 蛋白用 GDP處理 (lane 1) 或 GTPγS (lane 2) 用抗活性的  Ras進行免疫沉淀(Cat. No. 26910).用 anti Ras rabbit polyclonal antibody(Cat. No. 21021). 做免疫印跡分析。(圖A)

 Ras 蛋白用 GDP處理 (lane 1) 或 GTPγS (lane 2)用 anti Ras rabbit polyclonal antibody(Cat. No. 21021). 做免疫印跡作為參照（圖B)

 

 

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Publications:

1.  DNA vaccine elicits an efficient antitumor response by targeting the mutant Kras in a transgenic mouse lung cancer model     Gene Therapy 21, 888-896 (October 2014)

 

 

示例結果

 

下圖展示的是武漢紐斯特生物技術有限公司的 Ras 活性試劑盒的典型結果。下面的數據僅供參考

 

 Ras 活性分析

 Ras 蛋白用 GDP處理 (lane 1) 或 GTPγS (lane 2) 用抗活性的  Ras進行免疫沉淀(Cat. No. 26910).用 anti Rheb rabbit polyclonal antibody(Cat. No. 21098). 做免疫印跡分析。(圖A)

 Ras 蛋白用 GDP處理 (lane 1) 或 GTPγS (lane 2)用 anti Rheb rabbit polyclonal antibody(Cat. No. 21098). 做免疫印跡作為參照（圖B)