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Gα13 Pulldown Activation Assay Kit

 

產品說明

         

    從光子到大肽，結構多樣化的配體激活GPCRs他們的生理功能。配體結合的GPCRs，反過來，作為鳥嘌呤核苷酸交換在Gβγ存在下，Gα亞基上的GDP與GTP交換的催化因子，導致Gα亞基從Gβγ二聚體解離，形成兩個功能單元(Gα和Gβγ)。Gα和Gβγ亞基都向不同的細胞信號通路傳遞信號。根據序列在功能同源性方面，G蛋白分為4個家族:Gs、Gi、Gq G12。增加這些G蛋白的效應物和相互作用蛋白的數量已經被鑒定，生理上G蛋白參與的過程是增殖。在G蛋白的四個亞家族中，對G12/13亞家族的功能了解較少。在這個家族有兩個成員，G12和G13，它們無處不在地表達 Gα12基因敲除小鼠出現正常。Gα13敲除小鼠表現出胚胎致死率(~E9.5)。G 13α- /鼠標胚胎的維管系統有缺陷。G13也是酪氨酸激酶受體所必需的成纖維細胞和內皮細胞的遷移。

        

        而武漢紐斯特生物技術有限公司推出的 Gα13活性檢測試劑盒主要是依據單克隆抗體能夠特異性的識別特殊構象的Gα13 GTP 結合蛋白，而不識別Gα13 GDP結合蛋白，進而簡單并且快速的進行Gα13 的活性檢測。同時試劑盒中的Gα13 GTP 單克隆抗體也可以進行免疫組化實驗中細胞和組織中Gα13的活性監測。每套試劑盒可以進行 30 次檢測。

 

檢測原理

    

   武漢紐斯特生物技術有限公司的Gα13 活性檢測試劑盒主要是利用識別蛋白特異構象的Gα13 GTP 單克隆抗體特異性的去檢測細胞提取物或者體外的（樣品需要進行 GTPγS 活化處理）活性Gα13 GTP 的水平。簡言之，特異性識別Gα13 活化構象的鼠單克隆抗體可以特異性結合細胞裂解液中的Gα13 GTP 活性蛋白，然后利用 Protein A/G 將抗原抗體的結合物吸附下來，再利用識別Gα13的兔多克隆抗體進行免疫印跡分析進行檢測。

 

試劑盒組份及保存

 

 

 

試劑盒所需自備物品

 

1. 刺激和未刺激的細胞裂解物；

2. 蛋白酶抑制劑；

3. 4 °C 搖桿或者搖床；

4. 0.5 M EDTA (pH 8.0)；

5. 1 M MgCl2；

6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer；

7. 電泳和免疫印跡相關試劑；

8. 免疫印跡緩沖液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20)；

9. 免疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA)；

10 ECL 檢測試劑；

 

實驗操作步驟

 

A  試劑制備

1X Assay/Lysis Buffer：實驗前用去離子水將 5X 的 Assay/Lysis 緩沖液稀釋成 1X 的緩沖液，并在使用前加入蛋白酶抑制劑如 1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 µg/mLaprotinin（抑肽酶）。 

 

B  樣品處理

  貼壁細胞

1. 培養細胞密度達到大約 80%-90%之間（直徑 10 cm 培養皿，~107個細胞），并用活性劑或抑制劑進行處理。

2. 吸去培養基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

3. 向細胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個直徑 10cm 的組織培養皿中加入 0.5-1mL）。

4. 將培養皿放置于冰上處理 10-20 分鐘。

5. 用細胞刮棒把細胞從培養皿下分離下來。

6. 將細胞裂解物轉入合適的管中并放置于冰上。

7. 如果核發生裂解，細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現時，將細胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次，以破壞基因    組DNA，從而避免上述情況的出現。

8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

懸浮細胞

1. 培養細胞并用活化劑或抑制劑進行處理。

2. 計數細胞后離心。

3. 吸去培養基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

4. 向細胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個直徑 10cm 的組織培養皿中加入 0.5-1mL）。

5. 反復吹打細胞進行裂解。

6. 將細胞裂解物轉入合適的管中并放置于冰上。

7. 如果核發生裂解，細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現時，

  將細胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次，以破壞基因組DNA,從而避免上述情況的出現。    

8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

 

C.體外用 GTPγS/GDP 處理蛋白以用作陽性和陰性的對照(可選）

 

注意：在細胞體內環境條件下大約有 10%的Gα13被激活，而在體外用 GTPγS 處理大約有90%的Gα13 被激活。 

 

1. 準備兩個離心管，每個管中各加入 0.5 mL 的細胞提取物（如果是純的Gα13蛋白則每個管中加入的蛋白量為 1ug）。

2. 每個管中加入 20ul 0.5M EDTA(終濃度即為 20 mM)。

3. 一個管中加入 5ul 的 100X GTPγS（終濃度即為 100 uM）作為陽性對照。另一個管中加入 5ul 的 100X GDP（終濃度即為 1 mM）作為陰性對照。

4. 將離心管置于 30°C 條件下反應 30 min 并不斷攪動。

5. 終止反應：將管置于冰上并加入 32.5ul 1M MgCl2(終濃度即為 60mM)。 

 

D. 激活Gα13的親和沉淀

 

1. 加入 0.5-1 mL(總蛋白的含量大約為 1mg)的細胞裂解物至微量離心管中。

2. 用 1X Assay/Lysis 緩沖液。把每個樣品的總體積調整到1ml

3. 向管中加入 1ul 的活性Gα13 單克隆抗體。(Cat.# 26902)

4. 用渦旋振蕩儀將 protein A/G 凝膠柱充分混勻，

5 .然后快速的吸出 20ul 懸浮珠漿液加入離心管中。

6. 將管置于 4°C 條件下孵育1小時，并輕輕的進行搖動。

7. 5000g，離心 1 分鐘。

8. 棄上清，這一步要非常小心以避免珠子的損失。

9. 用 0.5 mL 的 1X Assay/Lysis 緩沖液洗滌珠子三次，離心并棄去上清。

10. 最后一次洗滌后，小心的移去所有的上清。

11. 用 20ul 的 2X SDS-PAGE 樣品緩沖液重懸樣品。

12. 樣品煮沸 5min。 

13. 5000g，離心 10s。

 

E. 蛋白印跡實驗 

1. 取 15ul 樣品/孔上樣 17%配體膠。

2. 按照制造商的說明進行 SDS-PAGE。

3. 按照制造商的說明將凝膠蛋白轉到 PVDF 或硝化纖維素膜。 

4. 將 PVDF 膜浸入 100%甲醇 15s，然后在室溫放置 5 min 晾干。 注意：如果使用的是硝化纖維 素膜，此步省略。 

5. 封閉； 用 TBST 緩沖液配制 5%的脫脂牛奶或者 3%BSA 在室溫下孵育 1小時進行封閉，并需要恒定振蕩。 

6 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

7. 孵育一抗：用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 稀釋Anti-Gα13 pAb(Cat.# 21005),稀釋比例為 1:50-1:1000，主要根據樣品中含有的Gα13 蛋    白的量）室溫下孵育 1-2 小時，或者 4°C 條件下過夜孵育.

8. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

9. 孵育二抗：（例如羊抗兔 IgG-HRP）用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 按1:1000 稀釋比例稀釋后使用，室溫下孵育 1 小時并恒定振蕩。

10. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

11. 使用實驗者所選擇的檢測方法進行顯色如 ECL 顯色法。

 

示例結果

 

下圖展示的是武漢紐斯特生物技術有限公司的Gα13活性試劑盒的典型結果。下面的數據僅供參考。

 

 

          

 

Gα13活性分析

 

MEF細胞用LPA處理 (lane 2) 或 不用LPA處理(lane 1)用抗活性的Gα13進行免疫沉淀(Cat.No.26902).用anti-Gα13 rabbit polyclonal antibody(Cat.No. 21005). 做免疫印跡分析。

 底部圖片；上圖細胞裂解液的5%用anti-Gα13 rabbit polyclonal antibody(Cat.No. 21005).做免疫印跡，作為一個參照。

 

 

   

 

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Publications:

1.  Identification of novel signalling roles and targets for Galpha and Gbetagamma downstream of the insulin-like growth factor 1 receptor in vascular smooth muscle cells     Biochem J. 2013 Feb 15;450(1):209-19

2.  CRH activation of different signaling pathways results in differential calcium signaling in human pregnant myometrium before and during labor     J Clin Endocrinol Metab. 2012 Oct;97(10):E1851-61

3.  CXCR4 activation defines a new subgroup of Sonic hedgehog-driven medulloblastoma     Cancer Res. 2012 Jan 1;72(1):122-32

4.  Regulation of estradiol and progesterone production by CRH-R1 and -R2 is through divergent signaling pathways in cultured human placental trophoblasts     Endocrinology. 2012 Oct;153(10):4918-28

5.  WNT-5A stimulates the GDP/GTP exchange at pertussis toxin-sensitive heterotrimeric G proteins     Cell Signal. 2011 Mar;23(3):550-4

6.  Heterotrimeric Galpha(i) proteins are regulated by lipopolysaccharide and are anti-inflammatory in endotoxemia and polymicrobial sepsis     Biochim Biophys Acta. 2011 Mar;1813(3):466-72

7.  Estrogen- and xenoestrogen-induced ERK signaling in pituitary tumor cells involves estrogen receptor-α interactions with G protein-αi and caveolin I     Steroids Volume 77, Issue 5, April 2012, Pages 424–432

8.  Na/H exchanger regulatory factors control parathyroid hormone receptor signaling by facilitating differential activation of G(alpha) protein subunits     J Biol Chem. 2010 Aug 27;285(35):26976-86

9.  Beta-arrestin- but not G protein-mediated signaling by the "decoy" receptor CXCR7     Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Jan 12;107(2):628-32

10.  Structural basis for activation of trimeric Gi proteins by multiple growth factor receptors via GIV/Girdin     Mol Biol Cell. 2014 Nov 5;25(22):3654-71

11.  Canonical and Non-canonical G-protein Signaling Helps Coordinate Actin Dynamics to Promote Macrophage Phagocytosis of Zymosan     Mol Cell Biol. 2014 Nov 15;34(22):4186-99

12.  Fatty Acid-binding Protein 5 (FABP5) Regulates Cognitive Function Both by Decreasing Anandamide Levels and by Activating the Nuclear Receptor Peroxisome Proliferator-activated Receptor β/δ (PPARβ/δ) in the Brain J Biol Chem. 2014 May 2;289(18):12748-58

 

 

 

示例結果

 

下圖展示的是武漢紐斯特生物技術有限公司的Gα13活性試劑盒的典型結果。下面的數據僅供參考。

 

 

          

 

Gα13活性分析

 

MEF細胞用LPA處理 (lane 2) 或 不用LPA處理(lane 1)用抗活性的Gα13進行免疫沉淀(Cat.No.26902).用anti-Gα13 rabbit polyclonal antibody(Cat.No. 21005). 做免疫印跡分析。

 底部圖片；上圖細胞裂解液的5%用anti-Gα13 rabbit polyclonal antibody(Cat.No. 21005).做免疫印跡，作為一個參照。