超值精品推薦：Arf6 Pulldown Activation Assay Kit (高分文獻來幫忙）

    
             ADP 核糖基化因子（Affs) 是真核細胞中廣泛表達的且是高度保守GTP結合蛋白家族，是Ras超級家族之一。Arfs 蛋白可以分為三類，第一類包括Arf1,Arf2 ,Arf3: 第二類包括Arf4和Arf5 第三類只有Afr6 與其他的 GTP 結合蛋白一樣，在非活性 GDP 結合狀態和活性 GTP 結合狀態之間循環。效應蛋白與 GTP 結合優先于 Arf6 的 GDP 結合狀態，為 Arf6 在細胞中的功能提供了基礎 ，Afr6 是在細胞質膜上發揮功能的Arf 蛋白 GTP 結合的Arf6 調節內吞膜的運輸同時調節細胞外周的細胞骨架變化，因此分析監測Arf6 的激活對研究Arf6 的功能提供了重要的依據。

           目前市面上常用的是利用效應蛋白 GGA3（高爾基體定位的含 γ 耳Arf 結合蛋白 3）的 Arf6 蛋白結構域 (PBD)，該蛋白已被證明可特異性結合 GTP 結合形式Arf6我們結合純化的 GGA3-PBD，“下拉”Arf6-GTP 并使用 Arf6 特異性抗體通過隨后的蛋白質印跡步驟量化活性 Arf6 的水平。
    
           武漢紐斯特生物技術有限公司的 Arf6活性檢測試劑盒主要是利用識別蛋白特異構象的 Arf6-GTP 單克隆抗體特異性的去檢測細胞提取物或者體外的（樣品需要進行 GTPγS 活化處理）活性 Arf6-GTP 的水平。簡言之，特異性識別 Arf6活化構象的鼠單克隆抗體可以特異性結合細胞裂解液中的 Arf6-GTP 活性蛋白，然后利用Protein A/G 將抗原抗體的結合物吸附下來，再利用特異性識別 Arf6 的兔多克隆抗體進行免疫印跡分析進行檢測。每個試劑盒可以進行30次免疫親和沉淀檢測 ，同時試劑盒中的 Arf6 GTP 單克隆抗體也可以通過免疫組化和免疫熒光實驗對細胞和組織中 Arf6 的活性進行監測。
        
             高分文獻解析

         脂肪肝（Fatty liver disease, FLD）是由于多種原因引起的肝臟細胞內脂肪堆積過多的?。ǎ?，是一種常見的肝臟病理改變，已成為全球肝損傷的主要原因【1】。FLD包括從簡單的脂肪變性到肝臟炎癥和纖維化，進展到晚期纖維化可導致肝硬化和肝細胞癌。有研究報告顯示，FLD相關的嚴重肝纖維化在世界范圍內的患病率預計將在未來10年內翻一番，并成為肝衰竭和癌癥的主要原因，對公共健康造成重大威脅【2】。盡管針對代謝異常的藥物取得了一定的進展，但目前還沒有藥物被批準用于治療FLD【3】。因此，迫切需要開發新的有效療法和鑒定非侵入性生物標志物。
          FLD具有家族聚集現象，有一定的遺傳傾向。迄今為止，PNPLA3、TM6SF2、GCKR、MBOAT7、HSD17B13、MARC1、APOE和GPAM的單核苷酸序列變異已被證明與FLD相關【4-6】。這些遺傳變異通過改變脂質分泌、脂滴重塑或增加脂肪新生來影響肝臟內的脂質代謝，并導致肝臟炎癥和纖維化，增加FLD發病和進展的風險。雖然近期在該領域取得了一定進展，但迄今確定的常見變異占疾病變異的比例還不到6%【7】，因此，研究人員致力于鑒定和揭示更多未知的影響肝臟脂肪含量的基因位點。
          2022年1月31日，來自瑞典哥德堡大學的Stefano Romeo 團隊與阿斯利康的Daniel Lindén團隊合作在Nature Metabolism雜志上在線發表了題為PSD3 downregulation confers protection against fatty liver disease 的研究論文，揭示了Pleckstrin and Sec7 domain-containing 3（PSD3）與FLD的關系。研究人員在PSD3 基因中鑒定了一個以前未知的與肝臟脂肪含量相關的基因位點rs71519934，該位點導致PSD3蛋白的186位亮氨酸到蘇氨酸的替換（L186T），從而降低了高危個體對FLD的易感性。機制探究發現，下調PSD3可以保護小鼠免受FLD，并防止脂質在人原代肝細胞和肝癌細胞中積累。該研究為FLD的治療開辟了新思路。

      為了鑒定先前未知的影響肝臟脂肪含量的基因位點，作者在達拉斯心臟研究（Dallas Heart Study, DHS）隊列（n = 2736）中檢測了候選基因變異與肝臟脂肪含量之間的關系，并在PSD3基因中發現了一個變異（rs71519934，L186T）與較低的肝臟脂肪含量相關（P=0.049）。DHS主要由歐洲裔美國人、非洲裔美國人和西班牙裔美國人組成。按種族分類后分析發現，PSD3 rs71519934基因型的歐洲美國人的循環總膽固醇水平有所降低。這些數據提示PSD3 rs71519934與FLD相關。隨后，作者在不同的隊列中進行了驗證，包括（1）肝臟活檢隊列（Liver Biopsy Cohort, LBC; n=1951)——來自北歐和南歐的非酒精性脂肪性肝?。∟on-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）高危人群；（2）來自英國生物庫隊列的參與者，他們的肝臟脂肪數據是可用的（n =10,970）；(3)來自中歐、有肝活檢的肥胖肝病高危人群（n=674）。所有數據均顯示PSD3序列變異降低了人類對FLD的易感性，因此，作者后續工作將重點探究PSD3影響FLD的分子機制。PSD3蛋白有18個注釋的亞型（isoforms），通過檢測來自LBC的77例肝臟活檢組織的轉錄組，作者發現isoform-a（在Ensembl中標記為001 ENST00000327040）在肝臟中表達水平最高。值得注意的是，FLD患者肝臟中的PSD3 mRNA水平顯著高于無FLD的患者，而N-acetyltransferase 2（NAT2）mRNA水平沒有明顯差異；進一步分析發現，無論是PSD3 mRNA還是NAT2 mRNA在不同PSD3基因型個體中的表達水平均沒有明顯差異。
      作者首先在186L或186T純合人原代肝細胞中探究了rs71519934次等位基因（來自英國生物庫樣本的外顯子組測序顯示，186T是歐洲人的次要等位基因）與低肝脂肪含量之間的關系。與186L人原代肝細胞相比，2D培養的186T人原代肝細胞中的中性脂質脂肪含量降低。作者用不同濃度（0, 10和25 mM）的油酸（oleic acid, OA）培養細胞，并檢測兩種基因型肝細胞中的PSD3蛋白水平，發現PSD3表達水平隨著OA濃度的增加而升高。然而，對于不同濃度的OA, PSD3蛋白在186T細胞中表達較低。通過RNA-seq分析參與脂質穩態的差異表達基因，作者發現，參與甘油三酯合成和分泌以及膽固醇生物合成的基因表達顯著減少。因此，作者推測PSD3 186T可防止細胞內脂質累積。由于PSD3在FLD患者肝臟中的表達升高，作者想知道PSD3下調是否會減少細胞內脂肪含量。與預期一致，在2D培養條件下，PSD3的下調降低了攜帶186L和186T這兩種等位基因的肝細胞內中性脂質含量; 然而，當在3D球體模型中培養時，PSD3下調僅降低了攜帶186L等位基因的原代肝細胞的胞內脂質水平。
       隨后，作者在大鼠（McArdle, McA-RH7777）180T純合子的永生化肝細胞中探究了遺傳關聯下的分子機制。結果顯示，下調Psd3可以顯著降低細胞內中性脂質含量、甘油三酯的生成以及參與甘油三酯合成的相關基因的mRNA表達水平。與對照相比，Psd3敲低的細胞中LDL的分泌也較低，而細胞內脂質利用并無差異。同時，作者在PSD3 186L等位基因純合子的人肝癌細胞（Huh7 cells）中測量了細胞內脂質積累和甘油三酯合成，并獲得了與McA-RH7777細胞完全相同的結果，表明內源性Psd3 186T或PSD3186L的下調導致細胞內脂質水平降低。PSD3是activating ADP-ribosylation factor 6（ARF6）的鳥嘌呤核苷酸交換因子，PSD3下調將導致活化的ARF6水平降低。
       最后，作者在小鼠體內探究了PSD3下調與FLD的關系。對C57BL/6小鼠進行為期50周的NASH（non-alcoholic steatohepatitis，非酒精性脂肪性肝炎）-誘導喂食，在最后16周，將小鼠分為Psd3 ASOs（反義寡核苷酸，可有效敲低內源性Psd3）治療組和對照ASO組。數據顯示，Psd3 ASO處理可使肝臟Psd3 mRNA表達水平降低98%，進而降低肝臟重量、肝臟總甘油三酯含量和血漿谷丙轉氨酶（alanine transaminase, ALT）水平（Psd3 ASOs不影響小鼠體重）。此外，Psd3 ASO降低了肝臟游離總膽固醇、肝臟膽固醇酯、血漿天冬氨酸轉氨酶 (aspartate transaminase, AST)、總膽固醇和LDL膽固醇水平，但不改變血漿甘油三酯或高密度脂蛋白（HDL）膽固醇水平。為了深入了解Psd3下調導致肝臟脂肪含量降低的機制，作者檢測了參與甘油三酯合成的基因表達水平。與體外實驗結果一致，在喂食NASH-誘導飲食的小鼠中，Psd3的下調降低了參與脂肪合成基因（Fasn, Acc1, Scd1）的表達，同時也降低了monocyte chemoattractant protein 1（Ccl2）的表達水平。作者在另一個小鼠模型中再一次證實了上述體內數據。
             總的來說，該研究鑒定了PSD3中一個新的與肝臟脂肪含量相關的基因位點rs71519934，該基因位點參與了高危個體對脂肪肝的易感性；并在小鼠、人原代肝細胞以及人類和嚙齒動物肝癌細胞中探究了遺傳關聯背后的分子機制：PSD3/Psd3下調可以保護小鼠免受脂肪肝，并防止脂質在人原代肝細胞和肝癌細胞中積累。作者認為需要進行更為深入的機制分析，進而評估PSD3治療FLD的潛力。


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   1. 文章中使用了 Arf6 Pulldown Activation Assay Kit 試劑盒中的抗體 （ Anti-active Arf6 mouse Monoclonal antibody  Cat#26918），原文如下    

2.文章中用于檢測Arf6 激活分析的試劑盒（ the cell lysates were incubated with GGA3 PBD agarose beads that  selectively isolate and pull down endogenous active ARF6 (ARF6–GTP).）原文如下

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